0 просмотров
Рейтинг статьи
1 звезда2 звезды3 звезды4 звезды5 звезд
Загрузка...

Гистологические методы исследования

Гистологическое исследование: когда оно назначается, как проводится и что показывает

Гистологическое исследование биопсийного материала — один из основных методов лабораторной диагностики новообразований. Это высокоточный способ, позволяющий оценить состояние и структуру клеток, поставить верный диагноз и проконтролировать эффективность терапии.

Что собой представляет гистологическое исследование

Гистологическое исследование — это изучение клеток биоптата (образца пораженной ткани) под микроскопом. Звучит достаточно просто, однако на самом деле метод этот довольно сложный, он предполагает различные технологии обработки биоматериала и различные способы микроскопии.

Биоматериалом для гистологического исследования могут быть образцы различных тканей — кожи, слизистых оболочек, мышц. Иногда гистологическому исследованию подвергается мазок — клетки эпителия, снятые при помощи специальной мягкой щеточки.

Методы проведения анализа

Методы гистологического исследования различаются по способу микроскопии. Выбор обычно определяется целями исследования: нужно ли качественное или количественное определение, выявление химического состава или внешних патологий структур…

Среди применяемых подходов можно выделить следующие методы микроскопии:

  • Световая — просвечивание в видимой части спектра.
  • Фазово-контрастная , позволяющая изучать клетки без окрашивания. Разновидностью этого метода является темнопольная микроскопия, дающая негативное изображение.
  • Интерференционная микроскопия, которая дает возможность определять концентрацию вещества в клетке и проводить количественные морфологические измерения.
  • Поляризационная , позволяющая определять характер расположения молекул в клетке.
  • Люминесцентная (флуоресцентная) , при которой клетки окрашиваются специальными красителями, заставляющими их светиться во флуоресцентном освещении.
  • Ультрафиолетовая — просвечивание в ультрафиолетовой части спектра.
  • Электронная , при которой для просвечивания используется не свет, а направленный пучок электронов.
  • Радиоавтография — исследование, предполагающее использование изотопных меток, позволяет оценить скорость обменных процессов в клетке.
  • Цитоспектрофотометрия — изучение химического состава клетки [1] .

Показания к назначению исследования

Когда показано проведение гистологического исследования? Этот метод диагностики используется во многих областях медицины. Особенно ценен этот метод при изучении новообразований — он позволяет определить их характер (доброкачественный или злокачественный), скорость роста, результативность терапии. Гистологические исследования широко используются в таких разделах медицины, как гастроэнтерология, оториноларингология, гинекология, урология, гематология, пульмонология, нефрология и других. Гистологическое исследование обязательно назначается при подозрении на опухоль, а также для определения стадии процесса. Его проводят перед назначением противоопухолевой терапии и во время лечения для контроля его эффективности (а также при необходимости — его коррекции).

Противопоказаний у метода практически нет — главное, чтобы была возможность взять биоптат. Ограничениями для проведения гистологического исследования могут стать нарушения свертываемости крови и аллергия на анестетики (эти факторы не позволят провести биопсию), тромбоцитопения, риск прерывания беременности, если исследование проводят женщине, ожидающей ребенка, а также некоторые заболевания, в частности, сердечная недостаточность [2] .

Как проводится гистологическое исследование: этапы процедуры

Гистологическое исследование подразделяется на несколько этапов.

Подготовка к исследованию

Зависит от способа и локализации места забора биоптата. Обычно эту процедуру проводят утром. Желательно проводить ее натощак, поскольку нередко биопсия предполагает местный наркоз или седацию. Поэтому последний прием пищи должен состояться за 8 часов до процедуры или раньше.

Взятие материала для гистологического исследования (биопсия)

Забор биоптата может производиться различными способами.

  • Во время хирургической операции (так называемая инцизионная биопсия ) врач берет образец пораженной ткани.
  • Щипковая биопсия — забор частички материала специальными щипчиками, которые нередко вводятся эндоскопическим методом.
  • Пункционная биопсия предполагает забор материала толстой иглой. Часто используется для получения образца клеток из печени и простаты.
  • Аспирационная биопсия — образец тканей получают при помощи отсасывания маленькой трубкой, этот способ используют для биопсии миоматозных узлов, узлов щитовидной железы и пр.
  • Эксцизионная биопсия — хирургическое удаление пораженных органов и тканей и их последующее исследование.
  • Трепан-биопсия применяется для забора жидкостей из костной ткани.
  • Кюретаж — соскабливание небольшого количества ткани из полости при помощи специальной ложечки-кюреты с острыми краями.
  • Мазок — забор клеток слизистых оболочек тонкой щеткой, похожей на щетку туши для глаз.

Забор биоптата — безопасная процедура, которая проводится под контролем УЗИ, риска повреждения органов нет.

Исследование материала

В современной медицине используются два способа проведения гистологического исследования.

При обычном способе полученный биоптат обрабатывают фиксирующим веществом, которое не дает ему распадаться под воздействием ферментов, и уплотняют, заливая парафином. Затем полученный препарат нарезают микротомом на «ломтики» толщиной не более 8 мкм и окрашивают. После этого препарат изучают при помощи микроскопа и выносят заключение. Обычно результаты готовы через 7–10 дней. Дольше всего приходится ждать результатов обследования биоптата костной ткани — около 2 недель.

Читать еще:  Для чего необходимы противовоспалительные препараты при комплексном лечении простатита

Однако иногда результаты гистологического исследования нужны врачу немедленно, в течение часа — например, при проведении операции, когда встает вопрос о немедленном удалении или сохранении органа. В этом случае применяется ускоренная методика гистологического исследования, при которой биоптат замораживают, режут микротомом и сразу проводят микроскопию. Исследование занимает всего час или менее [3] .

Что показывает гистологическое исследование: принципы трактовки результатов

Гистологическое исследование — очень точный метод лабораторной диагностики. Ошибки крайне редки и вызваны в основном нарушением технологии при заборе биоматериала.

Как расшифровать результаты гистологического исследования? Сразу стоит оговориться, что результат, который выдается пациенту на руки, — медицинский документ, и только врач может интерпретировать его. Мы приводим лишь общую информацию об этом документе. Не пытайтесь на ее основании самостоятельно поставить себе диагноз и тем более назначить лечение.

В бланке результатов гистологического исследования всегда указывается имя пациента и его данные, дата и место забора биоматериала, тип исследованных тканей, способ исследования и растворы и препараты, которые применялись во время подготовки образца тканей.

Пациентов нередко тревожит объем заключения гистологического исследования. Обычно в заключении перечисляется огромное количество названий тканей, однако это еще не значит, что исследование обнаружило массу патологий. По правилам заключения специалист описывает вообще все типы тканей, обнаруженных в биоптате, даже если они совершенно здоровы.

Каждый тип тканей оценивается по нескольким параметрам — цвет, консистенция и плотность, наличие изменений, не вписывающихся в норму (таких, как прорастание, размягчение и пр.).

Стоимость исследования

Несмотря на всю сложность, гистологическое исследование стоит относительно недорого. В муниципальных медучреждениях при наличии полиса его делают бесплатно. Однако государственные лаборатории часто перегружены, и пациенту порой приходится долго ждать направления на биопсию и результатов анализа. Поэтому некоторые предпочитают заплатить из собственного кармана, но пройти исследование быстро. В коммерческих лабораториях стоимость гистологического исследования составляет около 3000–4000 рублей. Стоимость биопсии как таковой начинается от 1500–2000 рублей и может доходить до 8000 рублей в зависимости от сложности, способа проведения и типа биоматериала.

Гистологическое исследование требует строжайшего соблюдения технологии забора биоптата, его упаковки и перевозки. Это особенно важно, если транспортировка биоматериала от места забора до лаборатории будет долгой. Поэтому желательно, чтобы забор и исследование материала проходили в одном и том же месте (если есть такая возможность), в лаборатории, оснащенной самым современным оборудованием.

Гистологические методы исследования

Методы исследования в гистологии включают приготовление гистологических препаратов и их изучение с помощью световых или электронных микроскопов. Гистологические препараты представляют собой мазки, отпечатки органов, пленочные препараты, тонкие срезы кусочков органов, окрашенные тем или иным красителем (исследуются также нативные — неокрашенные срезы), помещенные на предметное стекло, заключенные в бальзам и покрытые тонким покровным стеклом.

Для изготовления гистологического препарата необходимо после взятия материала произвести его фиксацию в том или ином фиксаторе (формалине, спирте, а для электронной микроскопии — в глутаровом альдегиде и четырехокиси осмия). Делается это для предотвращения процессов аутолиза и сохранения структуры органа, близкой к прижизненной. Далее следуют этапы обезвоживания кусочка органа в спиртах возрастающей концентрации и в ксилоле с целью уплотнения тканей, что необходимо для изготовления тонких срезов. Для придания кусочку органа еще большей плотности и гомогенности, обеспечивающей высококачественную резку, проводят его заливку в органическую среду — парафин, целлоидин (для световой микроскопии) и органические смолы (эпон, аралдит, дуркупан) — для электронно-микроскопического исследования.

Существуют также физические способы фиксации материала, наиболее распространенным из которых является быстрое замораживание кусочка органа с помощью жидко.го азота и других средств. Для резки замороженного материала используют специальные приборы — криостаты, или замораживающие микротомы.

Читать еще:  Дифференцированный подход к лечению больных стенокардией контрольный период

Толщина срезов, предназначенных для световой микроскопии, не должна превышать 4-5 мкм, для электронной — 50-60 нм (такие ультратонкие срезы изготавливают на специальном приборе ультратоме, используя стеклянные или алмазные ножи и автоматический режим резки).

После получения срезов их помещают на предметные стекла, далее следуют этапы освобождения срезов от заливочной среды (при световой микроскопии) и окраски для придания срезам контрастности. Среди гистологических красителей наиболее часто употребляется сочетание гематоксилина, маркирующего ядро (кислотные молекулы), и эозина, избирательно окрашивающего белковые молекулы (цитоплазматический краситель).

По окончании окрашивания срезы заключают в консервирующие среды (канадский, кедровый бальзамы) и накрываются покровным стеклом.

Основным методом гистологического исследования клеток, тканей и органов является световая микроскопия. В световом микроскопе для освещения объекта используются лучи видимого спектра. Современные световые микроскопы позволяют получать разрешение порядка 0,2 мкм (разрешающая способность микроскопа — это то наименьшее расстояние, при котором две рядом расположенные точки видны как отдельные). Разновидности световой микроскопии — фазово-контрастная, интерференционная, поляризационная, темнопольная и др.

Фазово-контрастная микроскопия — метод изучения клеток в световом микроскопе, снабженном фазово-контрастным устройством. Благодаря смещению фаз световых волн в микроскопе такой конструкции повышается контрастность структур исследуемого объекта, что позволяет изучать живые клетки.

Интерференционная микроскопия. В интерференционном микроскопе падающие на объект световые пучки раздваиваются — один пучок проходит через объект, другой — идет мимо. При последующем воссоединении пучков возникает интерференционное изображение объекта. По сдвигу фаз одного пучка относительно другого можно судить о концентрациях различных веществ в исследуемом объекте.

Поляризационная микроскопия. В микроскопах этого типа световой пучок разлагается на два луча, поляризованных во взаимно перпендикулярных плоскостях. Проходя через структуры ткани со строгой ориентацией молекул, лучи запаздывают друг относительно друга вследствие неодинакового их преломления. Возникающий при этом сдвиг фаз является показателем двойного лучепреломления клеточных структур (таким способом были исследованы, например, миофибриллы).

Тема 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА

Тема 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА

Основным методом исследования в гистологии является микроскопирование – изучение гистологических препаратов под микроскопом. В последнее время микроскопия сочетается с другими методами – гистохимией и гисторадиографией. Для микроскопии используют различные конструкции микроскопов, позволяющие изучать различные параметры гистологических препаратов.

Выделяются следующие виды микроскопии:

1) световая микроскопия (наиболее распространенный вид микроскопии, при этом разрешающая способность микроскопа составляет 0,2 мкм);

2) ультрафиолетовая микроскопия (разрешающая способность микроскопа составляет 0,1 мкм);

3) люминисцентная микроскопия (применяется для определения в исследуемом гистологическом препарате определенных химических структур);

4) фазово-контрастная микроскопия (применяется для обнаружения и изучения определенных структур в неокрашенных гистологических препаратах);

5) поляризационная микроскопия (используется в основном для изучения волокнистых структур);

6) микроскопия в темном поле применяется для изучения живых объектов;

7) микроскопия в падающем свете (предназначена для изучения толстых объектов);

8) электронная микроскопия (наиболее современный вид микроскопии, имеющий разрешающую способность 0,1 – 0,7 нм). Имеются две разновидности электронной микроскопии – просвечивающая (трансмиссионная) и сканирующая (или растворная) микроскопия, дающая отображение поверхностных ультраструктур.

Гистологические и цитохимические методы применяются для определения состава химических веществ и их количества в определенных структурах. Принцип метода заключается в химической реакции между реактивом и субстратом, содержащимся в исследуемом веществе. При этом образующиеся побочные продукты реакции можно обнаружить с помощью световой или люминисцентной микроскопии.

Метод гистоавторадиографии позволяет выявить состав химических веществ в исследуемых структурах и интенсивность обмена по включению радиоактивных изотопов. Данный метод чаще всего используется при экспериментах на животных.

Метод интерферонометрии позволяет определять сухую массу вещества в живых или фиксированных объектах.

Метод культуры клеток – это выращивание клеток в пробирках или в особых капсулах в организме и последующее изучение живых клеток под микроскопом.

Метод витального окрашивания – введение животным в кровь или в брюшную полость красителя (трепанового синего), который при жизни животного захватывается определенными клетками – макрофагами, а после забоя животного и приготовления препарата определяются и подсчитываются клетки, содержащие краситель.

Читать еще:  Аппарат для лечения простатита особенности принцип работы и отзывы

Иммуноморфологические методы позволяют с помощью предварительно проведенных иммунных реакций (на основе взаимодействия антиген – антитело) определять субпопуляцию лимфоцитов, степень чужеродности клеток, проводить гистологическое типирование тканей и органов, т. е. определять их гистосовместимость для дальнейшей трасплантации.

Метод дифференциального центрифугирования – изучение отдельных органелл или даже их фрагментов, выделенных из клетки. Для этого кусочек исследуемого органа растирают, заливают физиологическим раствором, а затем разгоняют в центрифуге при различных оборотах (от 2 до 150 тыс. в 1 мин). В результате центрифугирования получают интересующие фракции, которые затем изучают различными методами.

Методы морфометрии – количественные методы. Они позволяют определять размеры и объемы ядра – кариометрия, клеток – цитометрия, органелл – электронная морфометрия, а также определять число клеток различных популяций и субпопуляций. Данные методы широко используются в научных исследованиях.

Различные экспериментальные методы – пищевая и водная нагрузка, физические методы (УВЧ, СВЧ, лазеры, магниты). Они применяются для изучения реакции интересующих структур на то или иное воздействие и сочетаются с методами морфометрии, цито– и гистохимии. Данные методы также применяются в научных исследованиях.

Таким образом, основным и наиболее распространенным методом изучения в гистологии является микроскопия. Приготовление гистологического препарата включает в себя следующие этапы.

1. Взятие материала – кусочка ткани или органа. При заборе материала необходимо выполнять следующие правила:

1) забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя животного, при возможности от живого объекта, чтобы как можно лучше сохранить структуру исследуемых клеток;

2) забор материала должен проводиться острым инструментом, чтобы не травмировать ткани;

3) толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий раствор смог проникнуть на всю глубину ткани;

4) обязательно необходимо произвести маркировку кусочка, при этом указываются наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата забора.

2. Фиксация материала. Данный этап проводится для того, чтобы остановить обменные процессы в клетке и сохранить ее от распада. Для этого взятый на исследование кусочек ткани погружают в фиксирующий раствор. Раствор может быть простым (спирт или формалин) и сложным (раствор Карнуа, фиксатор Цинкера). Фиксатор вызывает денатурацию белков и сохраняет структуру клеток в состоянии, близком к прижизненному. Фиксацию можно проводить также путем замораживания – охлаждением жидким азотом или струей углекислого газа.

3. Заливка кусочков ткани в уплотняющие среды (парафин, смолы) – или замораживание. Данный этап необходим для того, чтобы в последующем из исследуемой ткани можно было изготовить тонкий срез.

4. Приготовление срезов на микротоме или ультрамикротоме с помощью специальных ножей. После этого срезы для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной – монтируются на специальные сеточки.

5. Окраска срезов или их контрастирование (для электронной микроскопии). Перед окраской срезов необходимо удалить уплотняющую среду – выполнить депарафирование. С помощью окраски достигается контрастность изучаемых структур. Красители можно подразделить на основные, кислые и нейтральные. Наиболее широко применяются основные красители (гематоксилин) и кислые (эозин). Часто используются и сложные красители.

6. Просветление срезов в ксилоле и толуоле. Их заключают в смолы (бальзам и полистирол) и закрывают покровным стеклом.

После данных процедур препарат можно исследовать под световым микроскопом. Помещенные под стекло срезы для светового микроскопа могут долго храниться и многократно использоваться. Для электронной микроскопии каждый срез используется только 1 раз, при этом он фотографируется, и изучение структур ткани производится по электронограмме.

Если ткань имеет жидкую консистенцию (например, кровь, костный мозг), то препарат изготавливают в виде мазка на предметном стекле, который затем также фиксируется, окрашивается и изучается.

Из ломких паренхиматозных органов изготавливают препараты в виде отпечатка органа, проводят разлом данного органа, затем к месту разлома прикладывают предметное стекло, на которое приклеиваются свободные клетки. После этого препарат фиксируется и изучается.

Из некоторых органов (например, брыжейки, мягкой мозговой оболочки) или из рыхлой волокнистой соединительной ткани изготавливают пленочные препараты путем растягивания или раздавления между двумя стеклами с последующей фиксацией и заливкой в смолы.

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector